风兰固体种子的比例组织培养表格技术培养基

基金项目：2019 年培养基浙江省访问工程师msa项目（几种园林植物的组培快繁技术研究，FG2019183）；镇江市科技1000毫升创新项目（优质成本价花卉风兰新品种选育，NY2019018）；宁波市科技富民项目（野生风兰资源保护与产业化关键技术研究，ZWT15112）。

林立

风兰 （Neofinetia falcata ）隶属于兰科（ Orchidaceae ）风兰属（ Neofinetia ），是一种稀有的附生类兰花品种，主要分布于我国江西、四川、福建、浙江等地的溪谷密林中，在日本和朝鲜半岛也有分布 。风兰株型小巧，高8～10 cm，叶片翠绿，花色洁白，有香味，ms培养基和wpm培养基，具有极高的观赏价值。此外，风兰叶片黄酮含量较高，具有一定的药用保健价值 。在日本和韩国，风兰被当地人们大量栽培，其中日本选育的风兰品种超过 200 个 。近年来，我国风兰产业逐步兴起，市场规模不断扩大。然而，由于风兰人工繁殖速度极慢，1 年 1 株仅成本价繁殖 2～3 个芽，难以满足市场的需求，这使得我国野生风兰遭盗采、盗挖现象严重，目前江西宜春、浙江舟山等地已难见野生风兰分布。因此，对我国风兰产业而言，繁殖技术已成为了制约产业发展的瓶颈。

组培技术是解决风兰繁殖问题的有效途径。目前，国内外有关风兰组培技术的研究报道还较少。1997 年，杨柏云用风兰成熟未开裂蒴果的种子成功诱导出了原球茎 。2002 年，胡如善等 采用风兰茎尖作为外植体成功诱导分化形成了再生植株，并筛选出了最佳的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基配方。后来，王裕等 对大叶风兰花梗腋芽组培技术进行了研究，成功地诱导分化出了再生植株。同时也对培育的试管苗进行了驯化和移栽试验，成活率达 86%。2009 年，李婧嫄等 [7] 用短距风兰（ N. richardsiana ）未开裂蒴果种子成功培育出了短距风兰组培苗。2011 年，张小燕 将短距风兰种子放入 1/2 B 5 +6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基，结果表明，种子萌发率达到了 71.67%。由于野生风兰数量稀少，相比于以花梗或茎间为外植体，利用种子进行快繁可以减少对野生风兰资源的破坏。本研究探讨了风兰固体种子的比例组织培养表格技术培养基，以期为风兰组培苗的快速生产和推广提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018 年 6～8 月于宁波奉化采集琼脂风兰成熟未开裂蒴果，带回实验室表各用元素吸水纸包裹放于 4℃冰箱中冷藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒。取风兰成熟的未开裂蒴果洗净并吸干水分，用 75%酒精棉球擦拭多次后进行酒精灯外焰消毒，然后剪开蒴果将表各成熟种子均匀撒于诱导培养基表面。

1.2.2 种子萌发，ms培养基配方表计算。前期试验结合前人研究表明，风兰种子诱导以 1/2MS 培养基效果最好，并且加入有机添加物香蕉泥wpm比苹果泥或马铃薯泥效果更好 。萌发培养基为：1/2MS+1.0g/LAC+30g/L蔗糖 +7.0g/L琼脂 +100g/L香蕉泥 + 不同激素组合，pH 值 5.8。培养室温度设为 25±2℃，光照强度 35μmL/m 2 ·s，光照时长 12h。每组重复 3次，培养 40d 后统计原球茎诱导率。

萌发率（%）=（原6-BA球茎诱导计算成功瓶数 / 接种比例瓶数）×100

1.2.3 增殖与分化。原球茎增殖与分化的培养基为1/2MS+30g/L蔗糖 +7.0g/L琼脂 +100g/L香蕉泥 + 不同激素组合，pH 值 5.8，温度 25±2℃，光照强度 40μmL/m 2 ·s，ms培养基配方表各元素的量，光照时长 12h。每组重复 3 次，培养 4 周后统计原球茎增殖系数，筛选最优培养基。

增殖系数 = 增殖得到的原球茎数 / 接种表格原球茎数

1.2.4 生根与壮苗壮素。在培养瓶中选择长势良好且株高 2cm 以 上 风 兰 苗 进 行 生 根 试 验壮素 。 以 1/2MS+1.0g/LAC+15g/L 蔗糖 +7.0 g/L 琼脂 +100g/L 香蕉泥为基本培养基，ms培养基配方表成本价，分别设置 3 个 NAA 和 6-BA 浓度梯度，每个处理重复 3 次，通过正交试验筛选出最优表各生根培养基，ms固体培养基配方表。培养条件与增殖培养条件一样，60d 后观察生根情况，ms培养基配方表格。

生根率（%比例）=（生根苗数 / 接种苗数）×100

2 结果与分析

2.12ms中文1 原wpm球茎配制诱导

风兰种子萌发时，先由黄色逐渐变为浅黄色，1 个月后转绿，最后ms形成作用浅绿球状原球茎（图 1）。不同浓度6-BA 和 NAA 组合对风兰种子诱导效果相差较大表水（表1）。当 6-BA 浓度为 1.0mg/L、NAA 浓度为 0.5mg/L 时，风兰种子诱导效果最好，诱导率高达 95.87%。当 6-BA浓度为 0.8mg/L、NAA 浓度为 0.6 mg/L 时，诱导效果最差，诱导率只有 70.33%，并且出现较高比例褐化现象。

图作用 1 风兰种子加多原量球茎诱导计算

1 种子接种ms ；2 诱导细胞的原球茎

表12ms 1 不同激素组合诱导风兰种子原球茎结果

2.2 原球茎元素的增殖与分化

将风兰原蔗糖球茎转至增殖培养基上，原球茎增殖速度较快，4 周后即可形成风兰小苗。不同浓度激素组合对风兰原球茎增殖和分化的影响见表 2。当 6-BA 浓度较高时（3mg/L），风兰增殖系数较低，都低于并且出现部分褐化现象。当 NAA 浓度为 1.0mg/L，6-BA 浓度为0.5mg/L 时，风兰的增殖系数最大，为 55.46，并且原球茎长势良好、颜色翠绿，部分原球茎分化出小苗，长出2～4 片叶（表 2）。因此，选择 NAA、6-BA 浓度分别为1.0mg/L 和 0.5mg/L 为风兰原球茎增殖分化最优激素组合。

图 2 风兰原蔗糖球茎增殖

表 2 不同激素中文组合对风兰原球茎增殖的效果

2.3 风兰苗的生根壮素培养基

分化的风兰pca小苗接种到生根培养基中 10d 就能生根。新根呈半透明状，颜色嫩绿，后逐渐变粗变长，颜色变为琼脂深绿色（图 3）。由表 3 可知，不同msa处理组的生根情况差异明显。添加 0.5mg/L 6-BA 和 0.5mg/L NAA 的培养基，生根率最高，为 93%，平均根数也是最多，为 4.8条 / 株，说明 1/2MS+0.5g/LAC+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+15g/L 蔗糖 +7.0g/L 琼脂 +100g/L 香蕉泥为风兰的最优生根培养基。

表表矮 3 不同激素组合对风兰生根表矮的影响

图 3 风兰加多苗生根

1 培养 10d 的根 ；2 培养 40d 的根

2.4 炼苗配方与移栽

当组培苗长至 5cm，具配方 2～4 片叶加多且根系完整时配制即可移栽。移栽前先将组培瓶开口放至于温室中炼苗 8d，之后将组培苗取出洗净，晾干后待种。基质选用松鳞加少许泥炭。栽种时要注意遮荫和保湿，成活后可适当追肥12ms，成活率细胞在 95%以上。

图 4 风兰12ms元素组培苗1000毫升表各配方移栽

3 讨论

随着人们生活水平的提高，人们对优质花卉品种的需求日益加大，兰科植物素以高洁、清雅、幽香而为人们所喜爱。然而，大多数兰花品种都存在价格较高、养护管理困难等问题，令许多花卉爱好者望而却步。风兰相比于其他兰花品种而言，具有株型雅致、便于造型、养护管理简单等优点，而且还具有其他兰科植物少有的观根价值，市场潜力较大。目前，国内风兰产业发展迅速，造成了我国野生风兰资源破坏严重。风兰种子较小，一个蒴果中含有的种子多至数 10 万粒，因无胚乳培养基，所以绝大多数种子难以萌发 。目前，风兰主要依靠分株方法进行繁殖，但该种方法效率极低。因此，为满足我国风兰市场快速发展的需要，同时解决风兰开发利用和保护之间的矛盾，开发风兰组培快繁苗技术十分重要。

目前，组培技术已被广泛用于兰科植物的生产配制和繁育，如文心兰、蝴蝶兰、兜兰等兰花品种的组培技术已经非常成熟 。由于风兰开发较晚，组培技术体系还不完善。王裕等 对大叶风兰花梗腋芽的组培技术进行了研究，成功地诱导分化出了再生植株，但由于外植体采集困难且保存量时间短等原因，难以满足工厂化生产的需要。采用风兰未成熟种子为外植体进行组织培养，不仅灭菌相对容易，能减少褐化，保存时间也较长。章鹏程等 对大花蕙兰原球茎的诱导研究表明，6-BA和 NAA 的不同浓度组合对兰科植物种子萌发具有显著影响 。6-BA 浓度较高时对兰科植物种子诱导效果较好，NAA 浓度则在 0.5mg/L时为最佳。本研究中 6-BA浓度为 1.0 mg/L，NAA 浓度为 0.5 mg/L时，风兰种子诱导率达 95.87%。在风兰增殖分化阶段，6-BA 要控制在较低浓度。

当 6-BA 浓度达到 3mg/L时，风兰增殖表系数明显降低，并且容易出现褐化现象。张雪梅等 [15] 对铁皮石斛愈伤组织诱导研究也表明，6-BA 浓度较高时（＞1.0mg/L）会抑制原球茎增殖。NAA 浓度则要相对较高，浓度为1.0mg/L和 1.5mg/L时，原球茎增殖系高于 0.5mg/L浓度水平，并且原球茎长势良好，ms培养基配方表表格，部分原球茎能分中文化出小苗。在生根培养阶段，因组培苗已分化出 2～4 片叶，具有一定光合作用能力，因此，ms培养基配方表水加多少，适当减少了蔗糖含量以节约成本。

4 结论

本 研 究 筛 选 得6-BA 到 风 兰 种 子 萌 发 培 养 基 ：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1.0g/L AC+30g/L蔗糖 +7.0g/L琼脂 +100mg/L香蕉泥；增殖分化培养基：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖 +7.0g/L 琼脂 +100 g/L香蕉泥；生根培养基：1/2MS+0.5g/LAC+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+15 g/L蔗糖 +7.0 g/L琼脂 +100g/L香蕉泥，培养条件为 pH 值 5.8，ms培养基配方表，温度 25±2℃，ms培养基配方表6-BA，光照时长 12h。